Manipulando material genético
Para lograr las aplicaciones descritas anteriormente, los biotecnólogos deben poder extraer, manipular y analizar los ácidos nucleicos.
Revisión de la estructura del ácido nucleico
Para comprender las técnicas básicas utilizadas para trabajar con ácidos nucleicos, recuerde que los ácidos nucleicos son macromoléculas hechas de nucleótidos (un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada). Los grupos fosfato en estas moléculas tienen cada uno una carga negativa neta. Un conjunto completo de moléculas de ADN en el núcleo de los organismos eucariotas se llama genoma. El ADN tiene dos cadenas complementarias unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases emparejadas.
A diferencia del ADN en las células eucariotas, las moléculas de ARN abandonan el núcleo. El ARN mensajero (ARNm) se analiza con mayor frecuencia porque representa los genes codificadores de proteínas que se expresan en la célula.
Aislamiento de ácidos nucleicos
Para estudiar o manipular ácidos nucleicos, primero se debe extraer el ADN de las células. Se utilizan varias técnicas para extraer diferentes tipos de ADN. La mayoría de las técnicas de extracción de ácido nucleico implican pasos para romper la célula, y luego el uso de reacciones enzimáticas para destruir todas las macromoléculas no deseadas. Las células se rompen con una solución de detergente que contiene compuestos tamponantes. Para evitar la degradación y la contaminación, las macromoléculas como las proteínas y el ARN se inactivan usando enzimas. El ADN se saca de la solución usando alcohol. El ADN resultante, debido a que está formado por polímeros largos, forma una masa gelatinosa.
| Este diagrama muestra el método básico utilizado para la extracción de ADN. |
El ARN se estudia para comprender los patrones de expresión génica en las células. El ARN es naturalmente muy inestable porque las enzimas que descomponen el ARN están comúnmente presentes en la naturaleza. Algunos incluso son secretados por nuestra propia piel y son muy difíciles de inactivar. Similar a la extracción de ADN, la extracción de ARN implica el uso de varios tampones y enzimas para inactivar otras macromoléculas y preservar solo el ARN.
Electroforesis en gel
Debido a que los ácidos nucleicos son iones cargados negativamente a pH neutro o alcalino en un ambiente acuoso, pueden ser movidos por un campo eléctrico. La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar moléculas cargadas en función del tamaño y la carga. Los ácidos nucleicos pueden separarse como cromosomas completos o como fragmentos. Los ácidos nucleicos se cargan en una ranura en un extremo de una matriz de gel, se aplica una corriente eléctrica y las moléculas cargadas negativamente se empujan hacia el extremo opuesto del gel (el extremo con el electrodo positivo). Las moléculas más pequeñas se mueven a través de los poros en el gel más rápido que las moléculas más grandes; Esta diferencia en la tasa de migración separa los fragmentos en función del tamaño. Los ácidos nucleicos en una matriz de gel son invisibles hasta que se tiñen con un compuesto que les permite ser vistos, como un tinte. Los distintos fragmentos de ácidos nucleicos aparecen como bandas a distancias específicas de la parte superior del gel (el extremo negativo del electrodo) que se basan en su tamaño. Una mezcla de muchos fragmentos de diferentes tamaños aparece como un frotis largo, mientras que el ADN genómico sin cortar suele ser demasiado grande para atravesar el gel y forma una sola banda grande en la parte superior del gel.
| Se muestran fragmentos de ADN de seis muestras procesadas en un gel, teñidas con un tinte fluorescente y vistas bajo luz UV. |
Reacción en cadena de la polimerasa
El análisis de ADN a menudo requiere centrarse en una o más regiones específicas del genoma. También con frecuencia implica situaciones en las que solo una o unas pocas copias de una molécula de ADN están disponibles para su posterior análisis. Estas cantidades son insuficientes para la mayoría de los procedimientos, como la electroforesis en gel. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica utilizada para aumentar rápidamente el número de copias de regiones específicas de ADN para análisis posteriores (Figura 10.4). La PCR utiliza una forma especial de ADN polimerasa, la enzima que replica el ADN, y otras secuencias cortas de nucleótidos llamadas cebadores que se emparejan con una porción específica del ADN que se replica. La PCR se usa para muchos propósitos en laboratorios. Estos incluyen: 1) la identificación del propietario de una muestra de ADN dejada en la escena del crimen; 2) análisis de paternidad; 3) la comparación de pequeñas cantidades de ADN antiguo con organismos modernos; y 4) determinar la secuencia de nucleótidos en una región específica.
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| La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, se usa para producir muchas copias de una secuencia específica de ADN utilizando una forma especial de ADN polimerasa. |
Clonación
En general, la clonación significa la creación de una réplica perfecta. Típicamente, la palabra se usa para describir la creación de una copia genéticamente idéntica. En biología, la recreación de un organismo completo se conoce como "clonación reproductiva". Mucho antes de que se hicieran intentos para clonar un organismo completo, los investigadores aprendieron a copiar tramos cortos de ADN, un proceso que se conoce como clonación molecular.
Clonación Molecular
La clonación permite la creación de múltiples copias de genes, la expresión de genes y el estudio de genes específicos. Para obtener el fragmento de ADN en una célula bacteriana en una forma que se copiará o expresará, el fragmento primero se inserta en un plásmido. Un plásmido (también llamado vector en este contexto) es una pequeña molécula de ADN circular que se replica independientemente del ADN cromosómico en las bacterias. En la clonación, las moléculas de plásmido pueden usarse para proporcionar un "vehículo" en el que insertar un fragmento de ADN deseado. Los plásmidos modificados generalmente se reintroducen en un huésped bacteriano para su replicación. A medida que las bacterias se dividen, copian su propio ADN (incluidos los plásmidos). El fragmento de ADN insertado se copia junto con el resto del ADN bacteriano. En una célula bacteriana, el fragmento de ADN del genoma humano (u otro organismo que se está estudiando) se conoce como ADN extraño para diferenciarlo del ADN de la bacteria (el ADN del huésped).
Los plásmidos se producen naturalmente en poblaciones bacterianas (como Escherichia coli) y tienen genes que pueden aportar rasgos favorables al organismo, como la resistencia a los antibióticos (la capacidad de no verse afectado por los antibióticos). Los plásmidos han sido altamente diseñados como vectores para la clonación molecular y para la producción a gran escala de moléculas importantes, como la insulina. Una característica valiosa de los vectores plasmídicos es la facilidad con la que se puede introducir un fragmento de ADN extraño. Estos vectores plasmídicos contienen muchas secuencias cortas de ADN que pueden cortarse con diferentes enzimas de restricción comúnmente disponibles. Las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) reconocen secuencias de ADN específicas y las cortan de manera predecible; son producidos naturalmente por bacterias como mecanismo de defensa contra el ADN extraño. Muchas enzimas de restricción realizan cortes escalonados en las dos cadenas de ADN, de modo que los extremos cortados tienen un saliente monocatenario de 2 a 4 nucleótidos. La secuencia reconocida por la enzima de restricción es una secuencia de cuatro a ocho nucleótidos que es un palíndromo. Al igual que con una palabra palíndromo, esto significa que la secuencia lee lo mismo hacia adelante y hacia atrás. En la mayoría de los casos, la secuencia lee lo mismo hacia adelante en una cadena y hacia atrás en la cadena complementaria. Cuando se realiza un corte escalonado en una secuencia como esta, los voladizos son complementarios.
| En este (a) sitio de reconocimiento de enzimas de restricción de seis nucleótidos, observe que la secuencia de seis nucleótidos lee lo mismo en la dirección 5 'a 3' en una cadena como lo hace en la dirección 5 'a 3' en la cadena complementaria. Esto se conoce como palíndromo. (b) La enzima de restricción produce roturas en las cadenas de ADN, y (c) el corte en el ADN da como resultado "extremos pegajosos". Otra pieza de ADN cortada en ambos extremos por la misma enzima de restricción podría unirse a estos extremos adhesivos e insertarse en el espacio abierto por este corte. |
Debido a que estos voladizos son capaces de volver a unirse mediante enlaces de hidrógeno con voladizos complementarios en un trozo de ADN cortado con la misma enzima de restricción, estos se denominan "extremos adhesivos". El proceso de formar enlaces de hidrógeno entre secuencias complementarias en cadenas simples para formar ADN bicatenario se llama recocido. La adición de una enzima llamada ADN ligasa, que participa en la replicación del ADN en las células, se une permanentemente a los fragmentos de ADN cuando los extremos adhesivos se unen. De esta manera, cualquier fragmento de ADN puede empalmarse entre los dos extremos de un ADN plasmídico que se ha cortado con la misma enzima de restricción.
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| Este diagrama muestra los pasos involucrados en la clonación molecular. |
Los plásmidos con ADN extraño insertado en ellos se denominan moléculas de ADN recombinante porque contienen nuevas combinaciones de material genético. Las proteínas que se producen a partir de moléculas de ADN recombinante se denominan proteínas recombinantes. No todos los plásmidos recombinantes son capaces de expresar genes. Los plásmidos también pueden ser diseñados para expresar proteínas solo cuando son estimulados por ciertos factores ambientales, para que los científicos puedan controlar la expresión de las proteínas recombinantes.
La clonación reproductiva
La clonación reproductiva es un método utilizado para hacer un clon o una copia idéntica de un organismo multicelular completo. La mayoría de los organismos multicelulares se reproducen por medios sexuales, lo que implica la contribución del ADN de dos individuos (padres), lo que hace imposible generar una copia idéntica o un clon de cualquiera de los padres. Los recientes avances en biotecnología han permitido clonar reproductivamente mamíferos en el laboratorio.
La reproducción sexual natural implica la unión, durante la fertilización, de un esperma y un óvulo. Cada uno de estos gametos es haploide, lo que significa que contienen un conjunto de cromosomas en sus núcleos. La célula resultante, o cigoto, es entonces diploide y contiene dos conjuntos de cromosomas. Esta célula se divide mitóticamente para producir un organismo multicelular. Sin embargo, la unión de cualquiera de las dos células no puede producir un cigoto viable; Hay componentes en el citoplasma del óvulo que son esenciales para el desarrollo temprano del embrión durante sus primeras divisiones celulares. Sin estas disposiciones, no habría desarrollo posterior. Por lo tanto, para producir un nuevo individuo, se requieren un complemento genético diploide y un citoplasma de huevo. El enfoque para producir un individuo clonado artificialmente es tomar el óvulo de un individuo y eliminar el núcleo haploide. Luego, un núcleo diploide de una célula del cuerpo de un segundo individuo, el donante, se coloca en el óvulo. El huevo es estimulado a dividirse para que el desarrollo continúe. Esto suena simple, pero de hecho toma muchos intentos antes de que cada uno de los pasos se complete con éxito.
El primer animal agrícola clonado fue Dolly, una oveja que nació en 1996. La tasa de clonación reproductiva en ese momento era muy baja. Dolly vivió durante seis años y murió de un tumor pulmonar. Se especuló que debido a que el ADN celular que dio origen a Dolly provenía de un individuo mayor, la edad del ADN puede haber afectado su esperanza de vida. Desde Dolly, varias especies de animales (como caballos, toros y cabras) se han clonado con éxito.
Ha habido intentos de producir embriones humanos clonados como fuentes de células madre embrionarias. En el procedimiento, el ADN de un humano adulto se introduce en un óvulo humano, que luego se estimula para dividirse. La tecnología es similar a la tecnología que se utilizó para producir Dolly, pero el embrión nunca se implanta en una madre sustituta. Las células producidas se denominan células madre embrionarias porque tienen la capacidad de convertirse en muchos tipos diferentes de células, como las células musculares o nerviosas. Las células madre podrían usarse para investigar y, en última instancia, proporcionar aplicaciones terapéuticas, como la sustitución de tejidos dañados. El beneficio de la clonación en este caso es que las células utilizadas para regenerar nuevos tejidos serían una combinación perfecta para el donante del ADN original. Por ejemplo, un paciente con leucemia no necesitaría un hermano con una coincidencia de tejido para un trasplante de médula ósea.
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| La oveja Dolly fue el primer animal agrícola en ser clonado. Para crear Dolly, se eliminó el núcleo de un óvulo donante. El huevo enucleado se colocó al lado de la otra célula, luego se sorprendieron al fusionarse. Se sorprendieron nuevamente para comenzar la división. Se permitió que las células se dividieran durante varios días hasta que se alcanzó una etapa embrionaria temprana, antes de ser implantadas en una madre sustituta. |
Ingeniería genética
El uso de tecnología de ADN recombinante para modificar el ADN de un organismo para lograr rasgos deseables se llama ingeniería genética. La adición de ADN extraño en forma de vectores de ADN recombinante que se generan por clonación molecular es el método más común de ingeniería genética. Un organismo que recibe el ADN recombinante se llama organismo modificado genéticamente (OMG). Si el ADN extraño que se introduce proviene de una especie diferente, el organismo huésped se llama transgénico. Las bacterias, plantas y animales se han modificado genéticamente desde principios de la década de 1970 para fines académicos, médicos, agrícolas e industriales. Estas aplicaciones serán examinadas con más detalle en el próximo módulo.
Aunque los métodos clásicos de estudiar la función de los genes comenzaron con un fenotipo dado y determinaron la base genética de ese fenotipo, las técnicas modernas permiten a los investigadores comenzar en el nivel de secuencia de ADN y preguntar: "¿Qué hace este gen o elemento de ADN?" Esta técnica, llamada genética inversa, ha dado como resultado la inversión de la metodología genética clásica. Un ejemplo de este método es análogo a dañar una parte del cuerpo para determinar su función. Un insecto que pierde un ala no puede volar, lo que significa que la función del ala es el vuelo. El método genético clásico compara los insectos que no pueden volar con los insectos que pueden volar, y observa que los insectos no voladores han perdido alas. Del mismo modo, en un enfoque de genética inversa, la mutación o eliminación de genes proporciona a los investigadores pistas sobre la función del gen. Alternativamente, la genética inversa puede usarse para hacer que un gen se sobreexprese para determinar qué efectos fenotípicos pueden ocurrir.
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